Diagnosa DNA

Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu jaringan udang seperti insang, kaki renang ± 3.0 – 5.0 gram, 500 µl DNA Lysis Buffer (yang sudah mengandung 50 mM Tris Cl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 500 mM NaCl, 1% SDS, 10 µg/ml Proteinase), 400 µl ethanol absolute (96%), 50 µl aquabides steril atau buffer TE (Trisma base-EDTA pH 8 steril), klorin dan ethanol 70%, buffer Tag polymerase, Asam asetat glacial, ddH₂O, dNTPs, primer, Taq polymerase, gel agarose, es batu, TBE 0,5x, Ethidium Bromida, Loading dye, DNA marker, formamide.

Alat yang digunakan yaitu baki atau nampan, tisu, jarum, gelas plastik, alat bedah (pinset dan gunting), sentrifuge yang telah di atur suhunya 4ºC, mikrosentrifuge,  bath, vortex, tabung eppendorf, lemari es, mikropipet dan tips, botol duran, timbangan digital, microwave, horizontal elektroforesis, UV-transillumeter, dan mesin PCR. Berikut ini adalah tabel fungsi dari masing-masing alat. 

 Tabel 1 Fungsi Peralatan PCR

No.	Alat	Fungsi / Kegunaan
1	Tabung eppendorf	Mengisolasi DNA
2	Lemari es	Menyimpan sampel dan IQzyme
3	Mikropipet dan tips	Mengambil larutan
4	Mikrosentrifuge	Memisahkan molekul menurut berat jenis
5	Timbangan digital	Menimbang bahan
6	Microwave	Melarutkan agarose
7	Horizontal elektroforesis	Elekroforesis hasil isolasi
8	Botol duran	Menyimpan larutan
9	UV-Transillumeter	Melihat hasil elektroforesis
10	Mesin PCR	Perbanyak potongan DNA

Isolasi DNA dari jaringan udang yang telah difiksasi dengan ethanol dengan metode Lysis Buffer 

          Peralatan dan bahan – bahan yang akan digunakan disiapkan. Setiap sampel (kaki renang, insang, daging, kontrol positif, dan kontrol negatif) ditambah 500 µl DNA Lysis Buffer yang sudah mengandung Proteinase K. Kemudian jaringan udang tersebut digerus sampai hancur dengan menggunakan penggerus plastik yang steril. Kemudian gunakanlah jarum penusuk untuk tiap sampel pada saat membuat lubang di tutup effendorf. Setelah itu effendorf  tersebut diinkubasi selama 10 menit kedalam bath yang berisi air mendidih, kemudian biarkan effendorf dingin di suhu ruang. Lalu lakukan sentrifuse pada 10.000 rpm selama 10 menit. Kemudian diambil 400 µl dan dimasukan kedalam tabung baru dan lakukan sentrifuse pada 10.000 rpm selama 10 menit. Siapkan effendorf baru isi dengan 400 µl ethanol absolute (96%). Kemudian supernatan dimasukan ke dalam effendorf tersebut sebanyak 200 µl dan disentrifuse pada 10.000 rpm selama 15 menit. Setelah itu semua supernatant ethanol dibuang dan pellet DNA dikering anginkan di atas tissue. Digunakan selembar tissue untuk satu sampel untuk mencegah kontaminasi silang. Lalu larutkan pelet DNA dengan cara menambahkan sekitar 50 µl aquabides steril atau dengan buffer TE (Trisma base-EDTA pH 8 steril) kedalam tiap sampel yang ada. Biarkanlah beberapa menit dan jentik – jentikan tabung untuk mempercepat melarutkan atau lakukan dengan vortex. Kemudian semua sampel DNA harus disimpan pada freezer -20ºC hingga digunakan dalam analisa PCR. 

Deteksi Penyakit WSSV dengan PCR 

           Setelah melakukan proses ekstraksi DNA kemudian dilalukan proses PCR. Langkah yang pertama yaitu teteskan sampel yang telah disiapkan, kemudian simpan disuhu ruang. Setelah itu vortex sebentar dan campur dengan cepat, setelah itu tambahkan 0,5 µl iqzyme DNA polymerase dan vortex selama 20 detik, kemudian sentrifuse pada 12.000 gr (12.000 rpm 5 sampai 7 cm) selama 5 menit. Masukan 200 µl fase air atas ke tabung 1,5 ml, tambahkan 100 µl larutan CATB dan 900 µl akuabides, kemudian panaskan pada suhu 75 ºC selama 5 menit. Dinginkan ke suhu ruang dan sentrifuse pada 1200 gr selama 10 menit.  

DNA hasil PCR kemudian dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi 3%. Untuk mengetahui hasil PCR dengan penanda SSR, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose 3% (0,75 gram) yang dilarutkan dalam 25 ml buffer 0,5 x TBE. Sebanyak 8 µl DNA dari tabung PCR diambil dan dihomogenkan dengan 2 µl loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarose dengan hati-hati. Elektroforesis dilakukan selama 150 menit dengan tegangan 50 volt menggunakan alat elektroforesis horizontal. Setelah elektroforesis selesai, dilakukan pewarnaan dengan merendam gel selama 5 menit dalam larutan Ethidium Bromide dan dibilas dengan akuades selama 3 menit. Selanjutnya, hasil elektroforesis diamati pada UV-Transiluminator dan didokumentasikan dengan kamera digital.